Struktur und vorgeschlagener DNA-Abgabemechanismus eines marinen Roseophagen

Apr 10, 2024

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3609 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Schwanzbakteriophagen (Ordnung Caudovirales) machen die Mehrheit aller Phagen aus. Der lange flexible Schwanz von Siphophagen erschwert jedoch eine umfassende Untersuchung des Mechanismus der viralen Genübertragung. Hier berichten wir über die atomaren Kapsid- und In-situ-Strukturen der Schwanzmaschine des marinen Siphophagen vB_DshS-R4C (R4C), der Roseobacter infiziert. Das R4C-Virion, das aus 12 unterschiedlichen Strukturproteinkomponenten besteht, verfügt über einen einzigartigen fünffachen Scheitelpunkt des ikosaedrischen Kapsids, der die Genomübertragung ermöglicht. Die spezifische Position und das Interaktionsmuster der Schwanzrohrproteine ​​bestimmen den atypischen langen starren Schwanz von R4C und sorgen außerdem für eine negative Ladungsverteilung innerhalb des Schwanzrohrs. Ein Ratschenmechanismus unterstützt die DNA-Übertragung, die durch ein Absorptionsgerät initiiert wird, das strukturell dem phagenähnlichen Partikel RcGTA ähnelt. Insgesamt liefern diese Ergebnisse detaillierte Erkenntnisse über die intakte Struktur und unterstreichen den DNA-Abgabemechanismus für die ökologisch wichtigen Siphophagen.

Bakteriophagen, die am häufigsten vorkommenden biologischen Formen in der Biosphäre, tragen wesentlich zur Gestaltung der mikrobiellen Vielfalt, zur Vermittlung des genetischen Austauschs und zur Modulation des Kreislaufs biogeochemischer Elemente bei1,2,3,4. Alle bekannten Phagen besitzen ein proteinhaltiges Kapsid zur Genomverkapselung und die meisten nutzen einen speziellen Schwanzapparat, um einen Eintrittspunkt auf der Zellhülle für die Genomtranslokation zu erkennen und zu öffnen5,6,7,8. Phagen mit Schwanz (Caudovirales) können in drei verschiedene Typen eingeteilt werden: Myophage mit einem kontraktilen Schwanz (z. B. T4, Mu); Podophage mit kurzem Schwanz (z. B. P22, T7); und Siphophagen mit einem langen, nicht kontraktilen Schwanz (z. B. SPP1, λ)9.

Die meisten Schwanzphagen haben ein ikosaedrisches Kapsid, das hauptsächlich aus mehreren Kopien der Hauptkapsidproteine ​​(MCPs) besteht. Die erste Struktur wurde für den Siphophagen HK97 gelöst und dabei eine neue Proteinfalte namens HK97-Faltung identifiziert, die später trotz geringer Sequenzidentität in den Kapsidproteinen verschiedener anderer Phagen und Herpesviren gefunden wurde10. Auf dem Kapsid der Schwanzphagen ist einer der fünfzähligen Scheitel durch einen Portalkomplex ersetzt, der mit dem Phagenschwanz verbunden ist. Podophagen bauen nacheinander einen Stummelschwanz am fertigen Kopf zusammen, während Myophagen und Siphophagen unterschiedliche Phagenzusammenbauwege haben, wobei ihre komplexeren Schwänze aus mehreren Schwanzkomponenten bestehen, die in einer strengen Reihenfolge interagieren und sich über einen Kopf-Schwanz-Verbinder mit dem Phagenkapsid verbinden11, 12. Siphophagen und Myophagen verfügen über eine gemeinsame Schwanzbindungsmaschinerie mit zwei grundlegenden Kopfvervollständigungsproteinen, die je nachdem, ob sie das Portal erweitern oder reversibel schließen, als Adapter oder Stopper unterschieden werden12,13. Für die Schwanzmontage bildet sich zunächst ein Absorptionsapparat, der der spezifischen Erkennung und irreversiblen Wechselwirkung mit Wirtsrezeptoren (z. B. Lipopolysaccharid, Teichonsäure und Porinen) gewidmet ist14,15,16 und sich in seiner Komplexität erheblich von einfachen Schwanzfasern bis hin zu komplizierten Konstruktionen unterscheidet Schwanzspitzen oder Grundplatten7,17,18,19. Das Gerät bereitet dann die Polymerisation des zylindrischen Schwanzes vor, der aus drei wesentlichen Komponenten besteht: einem zentralen Kern, der aus gestapelten Ringen der Schwanzrohrproteine ​​(TTPs) besteht, die von den Terminatorproteinen bedeckt sind, in dem die Bandmaßproteine ​​(TMPs) positioniert sind11, 20,21,22,23,24. Obwohl grobe Vorstellungen über die Mechanismen der DNA-Abgabe und des Virusaufbaus von Phagen vorliegen, sind angesichts der strukturellen und genetischen Vielfalt der Phagenschwänze die genauen Prozesse, die mit dem Phagenaufbau, der Infektion und der DNA-Abgabe verbunden sind, für die meisten Phagen noch unklar.

Die Roseobacter-Klade ist eine dominante Gruppe von Meeresbakterien, die weit verbreitet in Küsten- und offenen Gewässern, Oberflächen- und Tiefseemeeren sowie Sedimenten verbreitet ist und für das globale biogeochemische Klima von Bedeutung ist25,26,27,28. Dementsprechend sind Phagen, die die Roseobacter-Gruppe (Rosophagen) infizieren, im Ozean weit verbreitet und gelten als wichtige biotische Faktoren, die die Biologie, Ökologie und Biogeochemie der Roseobacter-Gruppe beeinflussen29,30,31. Bisher wurden mehr als 50 Roseophagen isoliert und sequenziert, aber keiner wurde strukturell charakterisiert32. Wir haben kürzlich einen neuartigen Roseophagen, vB_DshS-R4C (R4C)33, charakterisiert, der den Dinoroseobacter shibae DFL12T infizieren könnte, eine allgegenwärtige Gruppe gramnegativer α-Proteobakterien der Roseobacter-Klade34. Der R4C-Phage ist ein eigenständiges Mitglied der Siphophagenfamilie, wie durch phylogenetische und vergleichende Genomanalysen festgestellt wurde33.

In dieser Studie verwenden wir Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Strukturvorhersage, um die atomare Struktur des Phagen-R4C-Kapsids und die In-situ-Struktur der Schwanzmaschinerie zu bestimmen, um den ausgeprägten langen starren Schwanz zu charakterisieren. Das Kapsid und das Schwanzrohrprotein werden mit nahezu atomaren Auflösungen von 3,63 Å bzw. 3,43 Å aufgelöst. Die C12-Rekonstruktion des Portal-Adapter-Komplexes mit einer Gesamtauflösung von 4,7 Å charakterisiert eine Adapterarchitektur, die an ihrer Peripherie eine zusätzliche Ig-ähnliche Domäne dekoriert. Spezifische Positionsmuster der negativen Ladungsverteilung innerhalb des Endrohrs liefern Hinweise auf den zuvor identifizierten Ratschenmechanismus, der die DNA-Übertragung unterstützt35. Darüber hinaus identifizieren wir ein Absorptionsgerät mit Strukturmerkmalen, über die bisher für andere Siphophagen nicht berichtet wurde, die jedoch denen des phagenähnlichen Partikels des Gentransfermittels von Rhodobacter capsulatus (RcGTA) ähneln36; aber ersteres stattet eine zusätzliche periphere Domäne im Megatron-Protein aus. Insgesamt löst und erforscht unsere Arbeit eingehend die intakte Struktur und den DNA-Abgabemechanismus eines ökologisch wichtigen Siphophagen.

Rohe Kryo-EM-Bilder des R4C-Phagen zeigen einen Viruskopf mit einem Durchmesser von ~66 nm und einen langen, nicht kontraktilen Schwanz mit einer Länge von ~110 nm (Ergänzende Abbildung 1A). Anhand dieser Daten wollten wir die Kryo-EM-Struktur des R4C-Kapsidkopfes bestimmen, die durch Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse auf eine Gesamtauflösung von 3,63 Å aufgelöst wurde (Abb. 1A, ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Tabelle 1). Die R4C-Kapsidschale weist ein quasi-ikosaedrisches Gitter mit T = 7 und einem größten Durchmesser von ~ 664 Å auf (ergänzende Abbildung 1B). Das Kapsid umfasst 415 Kopien des MCP (vBDshSR4C_006), organisiert in 11 Penton-Scheitelpunkte und 60 Hexons. Anschließend wurden die Atommodelle der MCPs innerhalb einer asymmetrischen Einheit erstellt, die ein Hexon plus ein pentameres Monomer enthielt (Abb. 1B, C). Durch strukturelle Überlagerung stellen wir fest, dass die Gesamtstruktur des R4C-MCP trotz einer geringen Sequenzidentität der von HK97 gp5 sehr ähnlich ist (ergänzende Abbildung 2, Abbildung 1D). Ähnlich wie die kanonische HK97-Faltung besteht das R4C-MCP aus einem langen N-terminalen Arm (N-Arm), einer Achsendomäne (A-Domäne), einer Peripheriedomäne (P-Domäne) und einer erweiterten Schleife (E -Schleife). Strukturelle Unterschiede zwischen den MCPs von R4C und HK97 sind hauptsächlich in der A-Domäne zu erkennen, wobei die Schleifen der Reste 155–167 und 202–218 des R4C-MCP im Vergleich zu denen von HK97 nach innen abgelenkt sind (Abb. 1D). Die Überlagerung von sechs Kopien des hexameren MCP-Monomers zeigt Konformationsheterogenität, wobei strukturelle Variationen hauptsächlich auf der E-Schleife und dem N-Arm lokalisiert sind (ergänzende Abbildung 3), was dazu beiträgt, den Deferentradius an der Deferentstelle der Kapsidschale unterzubringen. Solche strukturellen Variationen der E-Schleife und des N-Arms sind zwischen den Hexon- und Penton-MCPs deutlicher; Das heißt, die pentamere MCP-Untereinheit weist in ihrer Architektur insgesamt eine stärkere Biegung auf, wobei sich die E-Schleife um etwa 16° nach oben dreht, gegenüber dem N-Arm um etwa 14° (Abb. 1E). Diese strukturelle Abweichung führt zur adaptiven Bildung von Hexons und Pentons, die sich in Durchmesser und Höhe widerspiegeln. Der Penton weist im Vergleich zum Hexon (Höhe ~27 Å und Durchmesser ~148 Å) eine hervorstehende und schmalere Oberfläche (Höhe ~44 Å und Durchmesser ~130 Å) auf (Abb. 1F). Sowohl Penton als auch Hexon werden durch ähnliche interkapsomere Wechselwirkungsmuster zusammengesetzt, die überwiegend durch zwei benachbarte A-Domänen vermittelt werden. Bemerkenswert ist, dass die lange E-Schleife die äußere Oberfläche des MCP in Richtung der benachbarten P-Domäne überspannt und die Spitze der E-Schleife an den distalen N-Arm eines anderen beabstandeten Monomers grenzt, wodurch eine zirkulierende Kopf-an-Kopf-Wechselwirkung entsteht Modus (Abb. 1F); Solche Wechselwirkungen kommen häufig im Kapsid von Phagen vor37,38,39.

Eine ikosaedrische Rekonstruktion des R4C-Kapsids, radial von der Mitte zu den äußeren Bereichen der Dichtekarte gefärbt. B Dichtekarte einer asymmetrischen Einheit des Kapsids (transparentes Grau), angepasst an das entsprechende Modell der MCPs, die ein pentameres Monomer (orange) und ein Hexon (cyan) enthalten. C Repräsentative Abschnittsdichtekarten (graues Netz) und entsprechende Atommodelle (Stäbchen) von MCP veranschaulichen die Seitenkettenmerkmale. D Die Überlagerung des R4C-MCP und des HK97-MCP (PDB-ID: 1OHG, grau dargestellt) zeigt deren strukturelle Erhaltung und Variation. Oben links und rechts sind Nahaufnahmen der Strukturvarianten zu sehen. E Die Überlagerung von Pentamer- und Hexamer-MCPs zeigt die Konformationsheterogenität in den N-terminalen Armen und E-Schleifen. F Cartoon-Darstellungen (obere Felder) der Draufsichten eines Pentons (links) und eines Hexons (rechts) und die entsprechenden abgeschnittenen Oberflächendarstellungen (untere Felder) der Seitenansichten zeigen deren Vielfalt in Höhe und Durchmesser der hervorstehenden Oberfläche.

Um die strukturelle Stabilität der R4C-Kapsidanordnung weiter zu untersuchen, haben wir uns auf die detaillierten Wechselwirkungen zwischen den Kapsomeren konzentriert. Ein hierarchisches Netzwerk aus Penton-Hexon- und Hexon-Hexon-Wechselwirkungen vermittelt den Aufbau des R4C-Kapsids (Abb. 2A). Die Penton-Hexon-Wechselwirkungen werden hauptsächlich durch die beiden antiparallelen N-Arme benachbarter Kapsomere vermittelt (Abb. 2B); Diese Art von Wechselwirkungen werden auch bei Hexon-Hexon-Wechselwirkungen beobachtet (Abb. 2C). Außerdem sind die Hexon-Hexon-Wechselwirkungen in der Nähe der ikosaedrischen dreizähligen und quasi-dreizähligen Achsen in zwei Schichten unterteilbar, an denen neun Kapsomere aus drei verschiedenen Hexonen beteiligt sind: Die inneren Schichtwechselwirkungen umfassen P-Domänen von drei Kapsomeren, die am nächsten an der dreizähligen Achse positioniert sind (Abb. 2D), während die äußere Schicht durch Wechselwirkungen von P-Domänenvorsprüngen, zirkulierenden E-Schleifen von weiteren drei hexomeren MCPs und drei N-Armen von anderen MCPs gehalten wird (Abb. 2D). Beide Seitenflächen einer E-Schleife in der äußeren Schicht haben Kontakt mit der hervorstehenden G-Schleife und der P-Schleife aus der inneren P-Domäne, während die Spitze der E-Schleife – zusammen mit dem benachbarten N-Arm – eine enge Verbindung herstellt unterhalb der P-Domäne und bildet ein Netzwerk aus Wasserstoffbrücken und Salzbrücken, um kapsomere Wechselwirkungen zu stabilisieren (Abb. 2E). Bemerkenswert ist, dass die Kapsidhülle durch starke elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den beiden Schichten weiter stabilisiert wird (Abb. 2F, G). Positive elektrostatische Potentiale werden an den drei P-Domänen der inneren Schicht und an den Spitzen der N-Arme beobachtet (Abb. 2F), wobei negative Ladungen an den Kontaktbereichen der E-Schleifen der äußeren Schicht festgestellt werden (Abb. 2G). Eine ähnliche Oberflächenladungsverteilung am gleichen Ort findet sich in RcGTA36, jedoch nicht in HK9737 oder TW140 (ergänzende Abbildung 4). Darüber hinaus sind an den Grenzflächen benachbarter MCP-Untereinheiten innerhalb des Hexons oder Pentons auch komplementäre elektrostatische Potentialflächen erkennbar (Abb. 2H), die häufig als Interaktionsmodus für die Kapsidanordnung angesehen werden 41, 42. Schließlich kommen die drei P-Schleifen, die der dreizähligen Achse am nächsten liegen, miteinander in Kontakt und bilden einen Kanal mit einem Radius von 3,2 Å, der dem in HK97 (2,9 Å) und RcGTA (4,0 Å) ähnelt, aber kleiner ist in TW1 (6,0 Å) (Ergänzende Abbildung 4). Solche Inter-E-Loop-Wechselwirkungen können im TW1-Phagen schwach oder gar nicht vorhanden sein, was erklären könnte, warum zur Stabilisierung des Kapsids eine Dekoration durch zusätzliche Proteine ​​erforderlich ist. Insgesamt sind mehrere Interaktionsmodi für die Stabilisierung des Kapsids von R4C von Vorteil.

Ein Kapsomer-Netzwerk, das die Grenzflächen um die fünf-, drei- und zweizählige Achse enthält, dargestellt durch ein schwarzes Fünfeck, Dreieck bzw. Oval. In die Interaktionsanalyse werden ein Penton (P1) und vier Hexone (H1 bis H4) einbezogen. Antiparallele N-Arme sind über die Erweiterung auf benachbarte Kapsomere an den interkapsomeren Wechselwirkungen zwischen den Penton- und Hexon-MCPs (B) und zwischen zwei Hexon-MCPs (C) beteiligt. D, E Interaktionsmuster in der Nähe der dreizähligen Achse werden von außen betrachtet. Interaktionsdetails für ein Drittel der Schnittstelle in (D) sind in (E) dargestellt. Ein Wechselwirkungsnetzwerk aus Wasserstoffbrücken wird durch gelbe gestrichelte Linien markiert. F Darstellung der elektrostatischen Potentialoberfläche derselben Region wie in (D), mit Ausnahme der E-Schleifen (Cartoon-Darstellung). Die von der Oberfläche dargestellten Umrisse der E-Loops werden als schwarze Linien hervorgehoben. G Elektrostatische Potentialoberflächen von E-Schleifen, die durch Drehung um 180° durch (F) beobachtet werden. In der Nähe der Spitzen der E-Schleifen werden komplementäre elektrostatische Potentiale beobachtet. H Elektrostatische Potentialoberflächendarstellung zweier benachbarter Hexamer-MCP-Monomere. Komplementäre elektrostatische Potentiale treten an der Grenzfläche von Monomer A (oben rechts) und Monomer B (unten rechts) auf. Die Skala des elektrostatischen Potentials wird im Farbbalken (rot–weiß–blau) angezeigt.

Die typische HK97-Faltung von MCPs kommt auch bei Kapsidproteinen mariner und nichtmariner Phagen häufig vor. Die strukturbasierte phylogenetische Baumanalyse zeigt jedoch, dass MCPs von Phagen aus Meeresumgebungen trotz ihrer kontrastierenden Umgebung (z. B. Salzgehalt, osmotischer Druck usw.) keine separaten Cluster bilden (ergänzende Abbildung 5). Somit haben marine Phagen einen gemeinsamen Vorfahren mit nichtmarinen Phagen. Im Gegensatz zur kovalent vernetzten Kette im Kapsid von HK9737 oder der Bildung eines zusätzlichen (Dekorations-)Proteins zur Stabilisierung der Kapsidhüllen der Phagen BPP-141, TW140 und Mic38 wird das R4C-Kapsid durch nichtkovalente, interkapsomere Wechselwirkungen ohne zusätzliche Dekoration (ergänzende Abbildung 4). Das R4C-Kapsidgenom wird regelmäßig in gleichmäßig verteilten dichten Schichten mit einem moderaten Abstand zwischen den Schichten von ~ 24 Å verpackt (ergänzende Abbildung 1B). Im Vergleich zu anderen Caudoviren mit ähnlichen T = 7-Kapsidköpfen, wie z. B. Bakteriophage T7, Lambda, TW1, P47–2637,39,40,43,44,45, hat R4C ein Kapsid normaler Größe (Durchmesser 600–660 Å). beherbergt aber ein relativ kleineres Genom (36 kb gegenüber 40, 48 und 83 kb für T7, Lambda bzw. P47-26). Dieses kleinere Genom hat eine niedrigere berechnete Verpackungsdichte (0,44 bp/nm333,46) als die typische Verpackungsdichte von T = 7-Caudoviren (0,54 bp/nm3)47. Daher können regelmäßige und einfache Interaktionsmodi (dh ohne kovalente Vernetzungsketten oder dekorative Proteine) zusammen mit der relativ kleineren Genomgröße und dem geringeren Innendruck im R4C-Kapsid wirken und eine Folge davon sein.

Der R4C-Phage verfügt über einen langen, geraden Schwanzapparat, der bei der anfänglichen ikosaedrischen Rekonstruktion des viralen Kapsids nicht rekonstruiert werden konnte. Um weitere Einblicke in die Organisation und Funktion dieser Nicht-MCP-Komponenten zu gewinnen, verwendeten wir eine Reihe von Rekonstruktionsverfahren, um eine intakte Struktur des R4C-Virions (176 nm lang) mit einer In-situ-Struktur der Schwanzmaschine zu erhalten ( 119 nm lang) (Abb. 3A, B). Der einzigartige Portalscheitelpunkt von 12 Fünffachscheitelpunkten auf dem Kapsid wurde durch gezielte Klassifizierung klassifiziert, wobei eine Fünffachsymmetrie (C5) erforderlich war (ergänzende Abbildung 6A). Eine weitere Rekonstruktion des Portalscheitelpunkts mit C5-Symmetrie und ohne Symmetrie (C1) ergab Karten mittlerer Auflösung des C5-Portalscheitelpunkts (6,6 Å) und des C1-Portalscheitelpunkts (11,5 Å) (ergänzende Abbildung 6A). Zwei weitere Strukturen wurden nach mehreren Runden aufeinanderfolgender lokalisierter Klassifizierung und Subpartikelrekonstruktion mit unterschiedlichen Masken definiert: das dodekamerische C12-Portal und -Adapter (4,7 Å) und der C6-Stopper und -Terminator (6,6 Å) (Abb. 3B, ergänzende Abb. 6A, B). Die Filamentverfolgung und die zweidimensionale (2D) Klassifizierung des R4C-Schwanzes identifizierten einen nicht kontraktilen Schwanz, der aus mehreren Schichten von TTP-Scheiben um die TMPs herum besteht (Abb. 3C). Durch helikale Rekonstruktion mit C6-Symmetrie erhielten wir eine nahezu atomare Auflösungsdichte des Endrohrs, die ein röhrenförmiges Hexamer für eine Scheibe ergab (ergänzende Abbildung 6C). Die distalen Enden der R4C-Schwänze wurden erneut extrahiert und durch Auferlegen der C3-Symmetrie aufgelöst, was zu einer 4,5-Å-Struktur führte, die einen distalen C6-Schwanz (Dit), ein C3-Grundplattenmodul und drei C3-Schwanzfasertrimere enthielt (Abb. 3B, Ergänzende Abbildung 6D). Anschließend führten wir mit dem trRosetta-Server De-novo-Strukturvorhersagen für jede Schwanzkomponente durch (dies lag an der geringen Sequenzähnlichkeit mit den gemeldeten Strukturen)48. Alle vorhergesagten Modelle wurden sorgfältig anhand der Dichtekarten erstellt und die endgültigen Modelle passten gut in die entsprechenden Karten, was eine sichere Seitenkettenplatzierung des Endrohrs und eine eindeutige Rückgratplatzierung der anderen Proteine ​​​​ermöglichte (Abb. 3D).

A Zusammengesetzte Dichtekarten des Kapsids und des Schwanzapparats sind in Bezug auf proteinhaltige Komponenten gemäß der Genkarte in (F) gefärbt. BA-Schnittansicht der Dichtekarten des gesamten Virions, die innere Strukturinformationen des Genoms (grau), der Portalscheitelelemente (rosa), der Maßbandproteine ​​(TMPs, türkis) und der Peptidase (orange) enthüllt. Der Maßstabsbalken entspricht 10 nm. C Die 2D-Klassifizierungsbilder des gesamten Hecks (oben), des Heckrohrs (Mitte) und der Grundplatte (unten). D Für jede Untereinheit (Monomer) wird die segmentierte Kryo-EM-Dichtekarte in halbtransparentem Grau mit dem angepassten Atommodell (Band) angezeigt. E Draufsichten auf das Portal (i), den Adapter (ii), den Stopper (iii), den Terminator (iv), das Endrohr (v), den distalen Schwanz (vi), den Hub-Megatron-Komplex (vii) und die Schwanzfasern (viii) des R4C-Phagen. Bei den ersten sechs Polymeren sind die Untereinheiten mit ungerader und gerader Nummer in unterschiedlichen Farben dargestellt. F Schematische Darstellung und Zuordnung des Genmoduls, das für die 12 Strukturproteine ​​von R4C kodiert. ORFs, die für Nichtstrukturproteine ​​kodieren, sind grau eingefärbt.

Zusammenfassend berichten wir, dass der R4C-Phage aus 12 verschiedenen Proteinkomponenten (insgesamt 596 Proteine) besteht, einschließlich einer nicht modellierten Peptidase (vBDshSR4C_015) nahe dem distalen Ende von TMPs (Abb. 3B, E, F, Ergänzungstabelle 2). Wir sehen, dass sich 415 Hauptkapsidproteine ​​(vBDshSR4C_006) zu einem ikosaedrischen Kapsid zusammenfügen, wobei einer der fünf Scheitelpunkte, die von 12 Portalproteinen (vBDshSR4C_005) gebildet werden, in 12 Adapterproteine ​​(vBDshSR4C_004) eingebaut wird. Das Portal erstreckt sich bis in das Kapsid und ist von genomischer DNA umgeben, über der sich der Großteil einer ungeordneten, kondensierten DNA entlang der C12-Achse stapelt (Abb. 3B). Der Adapter dockt an den hexameren Stopperring an, wobei letzterer durch Stopperproteine ​​(vBDshSR4C_009) gebildet wird, die die DNA im Kapsid halten (Abb. 3B). Der 88 nm lange Schwanz besteht aus einem apikalen hexameren Ring aus Terminatorproteinen (vBDshSR4C_018); ein mittleres Endrohr mit insgesamt 120 TTPs (vBDshSR4C_010), die 20 Hexamerschichten bilden; und ein unterer hexamerer Ring bestehend aus sechs Dit-Proteinen (vBDshSR4C_013) (Abb. 3B, E). Unterhalb des Dit befindet sich die Grundplatte, bestehend aus 3 Hub-Proteinen (vBDshSR4C_014), 3 Megatron-Proteinen (vBDshSR4C_016) und 9 Faserproteinen (vBDshSR4C_017) (Abb. 3B, E). Die Grundplatte wird als trimerer Hub-Megatron-Komplex dargestellt, der mit drei klauenartigen Trimeren von Faserproteinen verbunden ist (Abb. 3A).

Wie bei den meisten Siphophagen besteht die Kopf-Schwanz-Verbindung von R4C aus den Portal-, Adapter- und Stopperproteinen, die in aufeinanderfolgenden Ringen organisiert sind (Abb. 4A). Der Verbinder verhindert das Austreten der stark verdichteten DNA und stellt die Interaktionsschnittstelle für die Bindung des Phagenschwanzes bereit (Abb. 4A)11.

Eine Seitenansicht (linkes Feld) der Kopf-Schwanz-Schnittstelle, bestehend aus Portal, Adapter, Stopper, Abschluss und einer Schicht Endrohr. Die Modelle jeder Untereinheit werden im Band dargestellt und in Bezug auf die Domäne gefärbt (rechtes Feld). Ein Pfeil zeigt die Tunnelschleife des Portalproteins an. B Schnittansichten der elektrostatischen Oberfläche des Portals (positiv, blau; negativ, rot). Die beiden Einschübe zeigen die geladenen Reste, die auf der Innenfläche des Portals verteilt sind, die durch die Kronendomänen (oben) und die Clipdomänen (unten) gebildet wird. C Schnittansichten der zusammengesetzten Karten des Portalscheitelpunkts, bestehend aus den Kapsid- und Genomkarten, die zur C1-Rekonstruktion beitrugen und mit den MCPs (Cyan) ausgestattet waren, sowie der Portal- und Adapterkarten, die zur C12-Rekonstruktion beitrugen und mit den MCPs ausgestattet waren Portal- (rosa) und Adapterproteine ​​(lila). Die Genomdichte wird intransparent dargestellt, die anderen Karten transparent. D Drei Schleifen des Portalproteins, die an Interaktionen mit den Genomen beteiligt sind, sind blau hervorgehoben. Die Dichtekarte aus der C1-Rekonstruktion zeigt die Schnittstellen zwischen dem Kapsid und dem Portal (E) sowie dem Kapsid und dem Adapter (F); Diese wurden durch die Flügeldomäne des Portalproteins (E) bzw. die Bindungsdomäne des Adapterproteins (F) vermittelt. G, H Detaillierte Schnittstelle zwischen dem Adapter (lila) und zwei Portalproteinen (unterscheidet durch rosa und blau). I, J Die Anpassung von Modellen des Stopperproteins (blau) und zweier Adapterproteine ​​(unterscheidet durch lila und rosa) in die C6-Karte (transparente Oberfläche) zeigt eine Symmetriefehlanpassung. An den elektrostatischen Wechselwirkungen beteiligte Rückstände werden als Stäbchen dargestellt. K–N Wechselwirkungen innerhalb und zwischen den Schichten im Stopper (unterscheidet durch Hell- und Tiefblau), Terminator (Hell- und Tiefgrün) und Endrohr (Hell- und Tiefgelb). Die Interaktion der Stopper- und Terminatorproteine ​​zwischen den Untereinheiten ist in (K) und (M) dargestellt, wobei die Zwischenschichtschnittstellen zwischen den Stopper- und Terminatorproteinen, den Terminator- und Endrohrproteinen in (L) und (N) dargestellt sind. , jeweils. Strukturelemente, die an Wechselwirkungen innerhalb und zwischen Schichten beteiligt sind, werden in verschiedenen Farben hervorgehoben.

Der Portalkomplex ist an der Kopfmontage, der Schwanzbefestigung sowie der Verpackung und Freisetzung des Genoms beteiligt49,50. Das R4C-Portalprotein, das ein kanonisches kegelförmiges Dodecamer mit einer Höhe von 10 nm bildet, weist trotz schlechter Sequenzkonservierung erhebliche strukturelle Ähnlichkeit mit Portalproteinen anderer Phagen auf (Abb. 4B, ergänzende Abb. 7). Das von oben nach unten charakterisierte Portalprotein besteht aus separaten Kronen- (Reste 476–551), Flügel- (1–300, 394–475), Stamm- (301–323, 377–393) und Clip-Domänen (324–376). 51 (Abb. 4A). Die C-terminale Kronendomäne besteht aus drei α-Helices (α9, α10 und α11), die durch kurze Windungen verbunden sind, und einem zusätzlichen ungeordneten C-Terminal mit 29 Resten (Abb. 4A). Die α9-Helices, die die mediale Oberflächenkontur an der Spitze des Portals umreißen, sind radial nach außen geneigt und präsentieren sich als trichterförmige Öffnung zum inneren Kapsid hin; Dies kann die Freisetzung von DNA erleichtern (Abb. 4B). Gleichzeitig können die positiv und negativ geladenen Reste, die die α9-Öffnung auskleiden, einschließlich K478, K486, K489, E485 und D479, die DNA-Translokation regulieren (Abb. 4B). Die Flügeldomäne bildet den zentralen Teil des Portals innerhalb des Kapsids, wobei eine lange, geknickte α-Helix (α8) die gesamte Portalflügeldomäne durchquert und als Wirbelsäule dient (Abb. 4A). Eine typische Tunnelschleife, die α8 verbindet, bildet den engsten Kanal mit einem Durchmesser von ~30 Å (Abb. 4A, B); Ein analoges Strukturmerkmal (z. B. die Phagen SPP1 und T4) schließt die DNA ein und verhindert ihren Rückfluss aus dem Kapsid52,53, wobei die spezifische Konformationsumlagerung in der Tunnelschleife die Genomfreisetzung reguliert54. Die Stammdomäne besteht hauptsächlich aus zwei α-Helices (α5 und α7), die die Flügel- und Clipdomänen verbinden (Abb. 4A). Die Clip-Domäne, die sich über die dicke Kapsidwand erstreckt, liegt teilweise außerhalb des R4C-Kopfes frei und interagiert mit den Adapterproteinen (Abb. 4A, C). Der Rest K365 der Clip-Domäne induziert einen positiv geladenen Ring auf der Innenfläche des Kanalauslasses (Abb. 4B); Im Phagen T4 wurde angenommen, dass positiv geladene Reste an dieser Position DNA während der frühen Genomverpackungsphase anziehen53. Die 31 Reste am N-Terminus des R4C-Portalproteins sind ungeordnet, befinden sich aber vermutlich an der äußeren Oberfläche des Portals, wie beim Phagen T4 vermutet, und diese Reste könnten die weitere Kopfassemblierung initiieren53.

Die C1-Dichtekarte des Portalscheitelpunkts zeigt starke genomische Dichten terminaler DNA entlang der Portalachse sowie zirkulärer DNA und mehreren Schichten genomischer DNA (Abb. 4C). Drei Regionen auf der Portalflügeldomäne interagieren eng mit der genomischen DNA und verankern diese über positiv geladene Reste: Das RRRLR-Motiv (Reste 257–274) verankert die zirkuläre DNA, wie es im Herpesvirus-Kapsid beobachtet wurde, und diese zirkuläre DNA wurde als Anker-DNA55 bezeichnet ; R100 und K105 an der 10-Reste-Schleife (Reste 99–108) und R453, K458 und K461 an der 12-Reste-Schleife (Reste 452–463) der Flügeldomäne erstrecken sich und interagieren mit der geschichteten genomischen DNA (Abb. 4D). ). Was die Portal-Kapsid-Wechselwirkung betrifft, liegt die α/β-Unterfalte an der Peripherie der Flügeldomäne nahe an der Innenwand des Kapsids mit einer geräumigen Grenzfläche, was zu einer 5- bis 12-fachen Symmetriefehlanpassung zwischen dem Portal und dem führt Kapsid (Abb. 4E, ergänzende Abb. 8A, B).

Der Portalkomplex wird von einem dodekamerischen Adapter abgedeckt, der sich außerhalb der Kapsidhülle befindet und sowohl mit dem Portal als auch mit den Kapsid-MCPs interagiert (Abb. 4C, F). Derzeit gibt es kein gemeldetes Protein mit einer ähnlichen Struktur, wie die DALI-Suche ergab56. Gemäß der für den RcGTA-Adapter festgelegten Nomenklatur kann das R4C-Adapterprotein unterteilt werden in: Bindungsdomäne (1–106), Röhrendomäne (107–130, 149–166), Adapterschleife (131–148) und C-terminaler Haken (167–178) (Abb. 4A). Der N-Terminus des Adapterproteins ist eine Immunglobulin (Ig)-ähnliche Domäne (Anheftungsdomäne), und diese Domäne ist durch eine lange, flexible Schleife mit der Röhrendomäne verbunden (Abb. 4A). Die dodekameren Bindungsdomänen werden im Uhrzeigersinn identifiziert und zeigen eine symmetriefehlangepasste Wechselwirkung innerhalb des R4C-Kapsids um die fünffache Symmetrie (Abb. 4F, ergänzende Abb. 8A, C). Die Ig-ähnliche Domäne kommt in vielen verschiedenen Strukturproteinen von Schwanzphagen vor und kann ein Produkt des grassierenden horizontalen Gentransfers zwischen Phagen sein57,58. Die Phagen-Ig-ähnlichen Domänen werden typischerweise in drei verschiedene Pfam-Familien (die Proteinfamilien-Datenbank) eingeteilt – Big2, I-Set und FN3 – mit vorgeschlagenen Funktionen bei der Erleichterung der Phagenadsorption und/oder der Erhöhung der Infektiosität59,60. Dennoch gehört die Ig-ähnliche Bindungsdomäne des R4C-Adapters zu keiner dieser Familien. Die Nähe des R4C-Adapters zum Phagenkopf legt nahe, dass die Bindungsdomäne wahrscheinlich nicht am Adsorptionsprozess während der Infektion beteiligt ist, sondern vielmehr mit der lokalen Konformationsstabilität zusammenhängt. Die Röhrendomäne besteht aus zwei α-Helices, wobei die α2 zwischen Schleifen benachbarter Portalproteine ​​liegt (Abb. 4G). Die Röhrendomäne verlängert den C-terminalen Haken bis zur Portal-Clip-Domäne und bildet ein Interaktionsnetzwerk aus fünf hybriden β-Faltblättern (Abb. 4H). Die Adapterschleife stellt eine Schnittstelle zur Bindung der Stopperproteine ​​dar.

Das Stopperprotein, ein entscheidendes Modul für den Kopfaufbau, weist gemeinsame Strukturmerkmale (antiparalleles β-Strang-Fass) mit anderen Siphophagen, Myophagen und phagenähnlichen Einheiten auf (ergänzende Abb. 9A, B) 61, 62. Insbesondere können zwei verschiedene Gruppen von Stopperproteinen basierend auf der Abwesenheit (z. B. RcGTA g736) oder der Anwesenheit (z. B. λ gpFII61) einer langen N-terminalen Verlängerung, die mit den Adapterproteinen interagiert, spezifiziert werden (ergänzende Abbildung 9A)63. Das Stopperprotein R4C mit seiner langen N-terminalen Verlängerung faltet einen Teil des N-Terminus als α-Helix und spielt eine entscheidende Rolle bei der Verbindung des Adapters (Abb. 4A und ergänzende Abb. 9A). Insbesondere bildet die N-terminale α-Helix eines Stoppermonomers einen engen Kontakt mit Schleifen von zwei benachbarten Adaptermonomeren (ungerade und gerade) (Abb. 4I). Unter ihnen bilden die Reste R145 und K131 zweier benachbarter Adaptoren, die über der α-Helix des Stopper-N-Terminus schweben, ein Netzwerk aus Salzbrücken mit den Resten D7 und D13 des Stopperproteins (Abb. 4I). Darüber hinaus bildet sich eine weitere elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem Rest D90 des Stopperkern-β-Strangs und dem Rest R141 der geraden Adapteruntereinheit (Abb. 4J). Mehrere hydrophobe Aminosäuren, darunter drei aromatische Aminosäuren innerhalb der Stopper-N-Terminus-Helices, nehmen an hydrophoben Stapelwechselwirkungen mit benachbarten Adapterschleifen teil (ergänzende Abbildung 8D, E). Schließlich wird ein Dodecamer-Stecker aus Adapterproteinen fest in eine Hexamer-Buchse aus Stopperproteinen eingeführt, was zu einer Symmetriefehlanpassung zwischen den beiden Komplexen führt (ergänzende Abbildung 8A, F).

Interessanterweise scheint die durch die N-Termini, die kurze Schleife, die Insertionsschleife und β2 gebildete R4C-Interstopper-Kontaktfläche (~274 Å2) zu klein für die Komplexbildung zu sein (Abb. 4K)64: Wir spekulieren darüber, ähnlich wie bei anderen Enden Phagen können die Stopperproteine ​​als Monomere in Lösung vorliegen und beim Einbau in den Kopf das Stopperhexamer bilden61,65. Der N-terminale Schwanz des R4C-Stoppers ähnelt dem gpFII des Phagen λ und kann als Monomer flexibel sein und sich nur dann zu Helices falten, wenn er korrekt mit den Adapterproteinen interagiert (ergänzende Abbildung 9A)61. Tatsächlich gewährleistet eine solche Konformationsänderung den ordnungsgemäßen Zusammenbau des gesamten Phagenkopfs66,67,68. Nach der Kopfmontage greift der R4C-Stopper in seine lange Schlaufe ein, um in eine vom Abschlussstück gebildete Nut zu passen, und verbindet den Kopf mit dem vormontierten Schwanz (Abb. 4L).

Bisher ging man davon aus, dass die Schwanzmontage in Siphophagen und Myophagen über einen Initiatorkomplex abläuft, der als Absorptionsgerät fungiert, gefolgt von der Polymerisation der TTPs um die TMPs12 und der Montage einer Hexamerkappe des Terminators auf dem vormontierten Schwanz zu einem vorher festgelegten Zeitpunkt Schwanzlänge (definiert durch TMPs), um eine fehlerhafte Polymerisation des Schwanzrohrs zu verhindern11,69,70. Wie wir beschrieben haben, fungiert der R4C-Terminator als Andockplattform für den vormontierten Kopf und Schwanz (Abb. 4A). Trotz geringer Sequenzähnlichkeit hat das R4C-Terminatorprotein eine gemeinsame Strukturtopologie mit der anderer langschwänziger Phagen (z. B. λ-Phage gpU11, SPP1 gp1771) und integriert Elemente eines mehrsträngigen β-Faltblatt-Fass und zwei Haupthelices der Peripherie (Ergänzende Abbildungen 9C, D und 10A). Die zentralen α-Helices und β3 haften an der benachbarten Terminatoroberfläche, die aus einer N-terminalen Helix, einer Insertionsdomäne und einem Segment von β1 besteht (Abb. 4M). Die Wechselwirkung zwischen dem R4C-Terminator und dem Endrohr beruht hauptsächlich auf der Bindung der Spitzen der langen β-Haarnadeln des Terminators an die kleine Furche, die von benachbarten Untereinheiten des Endrohrs gebildet wird (Abb. 4N). Der Rest M50 in der β-Haarnadelspitze dringt tief in den hydrophoben Hohlraum an der Wechselwirkungsschnittstelle ein, um die Schichtkopplung weiter zu stabilisieren (ergänzende Abbildung 10B).

Siphoviren besitzen typischerweise lange, nicht kontraktile, flexible Schwänze, deren Struktur schwierig zu charakterisieren ist. Im Gegensatz dazu ist der intrinsisch starre Schwanz von R4C, der sich als lange, gerade röhrenförmige Struktur aus 20 TTP-Schichten darstellt (Abb. 3A, B), für die Strukturaufklärung hilfreich. Mithilfe einer spiralförmigen Rekonstruktion wurde eine Dichtekarte des Endrohrs mit einer Auflösung von 3,43 Å erstellt. Die Karte zeigte eine Spiralarchitektur mit einem axialen Anstieg von ~40 Å und einer Drehung von 30° (Abb. 5A). Anschließend haben wir das Atommodell von TTP gelöst (Abb. 5B, C) und dabei eine Konservierung in den Hauptkörpern der TTPs zwischen R4C, SPP1, T4 und RcGTA festgestellt, wobei ein ähnlich verdrehtes β-Sandwich eine lange β-Haarnadel verlängert (Abb. 5C). , Ergänzende Abb. 9E, F). Diese Ergebnisse deuten auf eine bemerkenswerte Konservierung von TTPs in Siphophagen, Myophagen und anderen phagenähnlichen Partikeln hin36,72,73.

Gezeigt wird eine AA-Oberflächendarstellung der 3,43 Å Kryo-EM-Karte der Vier-Scheiben-Tail-Tube-Proteine ​​(TTPs), wobei ein TTP-Helixstrang blau hervorgehoben ist. Spiralförmiger Anstieg und Drehung sind angegeben. B Repräsentative Kryo-EM-Dichtekarten (Netz) und entsprechende Atommodelle (Stäbchen). C Die Seitenansicht (linkes Feld) und die Draufsicht (rechtes Feld) einer einzelnen Untereinheit des TTP sind in Banddarstellung dargestellt, wobei die α-Helices und β-Stränge in Rot bzw. Türkis gefärbt sind. Die β-Stränge sind fortlaufend nummeriert (β1–8). D Seitenansicht des Endrohrs (4 Scheiben) mit geteilter vorderer oberer Hälfte und dargestellter elektrostatischer Ladungsverteilung auf der Außen- und Innenfläche. Positiv (blau), negativ (rot), neutral (weiß). Der Außen- und Innendurchmesser des Endrohrs ist beschriftet. E Relative Positionen und Wechselwirkungen der benachbarten TTPs auf derselben Scheibe und auf zwei aufeinanderfolgenden Scheiben. Die lange Schleife (gelb) erstreckt sich nach unten und berührt das zentrale β-Fass der benachbarten Untereinheit (blau) derselben Scheibe und die darunter liegenden Untereinheiten (weiß und grau) der nächsten Scheibe. F–H Details der Wechselwirkungen zwischen TTP-Untereinheiten einer Scheibe. Zwei benachbarte Untereinheiten werden durch ein intersträngiges Wasserstoffbindungsnetzwerk (F) und zwei Salzbrückennetzwerke (G, H) stabilisiert, wie durch grüne bzw. orange gestrichelte Linien dargestellt. I–K Details der Wechselwirkungen zwischen TTP-Untereinheiten von zwei aufeinanderfolgenden Scheiben. Wechselwirkungen werden hauptsächlich durch unpolare Wechselwirkungen verursacht, wie durch die violette gestrichelte Linie dargestellt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist das Molekül mit den wichtigsten unpolaren Resten in einer Banddarstellung dargestellt, während die anderen Moleküle, die die hydrophobe Tasche bilden, in einer Moleküloberflächendarstellung dargestellt sind. Hydrophobe Oberflächen sind gelb und geladene Oberflächen türkis. Seitenketten der ausgewählten Reste sind in Stabdarstellung dargestellt.

Das helikale Endrohr hat einen Außendurchmesser von ~85 Å und einen breiten inneren Korridor von ~43 Å, der ein starkes negatives elektrostatisches Potential aufweist (Abb. 5D), wie es bei anderen TTPs beobachtet wird, und wahrscheinlich den DNA-Transport in den Wirt erleichtert74. Die Aspartat- (z. B. D27 und D108) und Glutamatreste (z. B. E32 und E57), die den Tunnel auskleiden, bilden eine negativ geladene, nahezu parallele Spiralspur durch das Endrohr (Ergänzungsbild 11A) mit einem äquidistanten Abstand von ~16 Å (Ergänzungsbeispiel). Abb. 11B). Angesichts der Tatsache, dass dieser Wert nahe am mittleren Abstand der kleinen und großen DNA-Furchen liegt, spekulieren wir, dass die DNA zwischen den Spuren eingeschlossen wird und daher aufgrund der elektrostatischen Abstoßung während der DNA-Translokation schnell entlang der rechtsdrehenden helikalen Flugbahn wandern kann. Ein analoger Ratschenmechanismus wurde auch für den Phagen YSD1 vorgeschlagen, der die DNA durch eine dem Polynukleotid innewohnende helikale Drehung ratschen lässt35. Dieses besondere molekulare Merkmal könnte die Migrationsgeschwindigkeit des Genoms verstärken, da die anfängliche treibende Kraft für die Genomfreisetzung – die vom inneren Turgordruck herrührt – rechnerisch nur den Eintritt von etwa 15 % der Genomlänge aufklären konnte41,42,43.

Die Wechselwirkungen zwischen den Monomeren innerhalb derselben TTP-Scheibe werden durch Wasserstoffbrückenbindungen im Grundgerüst zwischen den β-Faltblattschichten dominiert, mit zwei elektrostatischen Netzwerken für die unterstützte Bindung (Abb. 5E – H). Insbesondere interagiert β5 eines TTP mit β2 der benachbarten Untereinheit und bildet ein antiparalleles β-Faltblatt und ein ausgedehntes Wasserstoffbrückennetzwerk (Abb. 5F). Dies führt zu einer integrierten 24-strängigen β-Barrel-Struktur für eine Endrohrscheibe. Negativ geladene Reste (d. h. D67, E103 und E70) interagieren mit positiv geladenen Resten der benachbarten Untereinheit (d. h. R91 und K126) und bilden so ein dichtes Netzwerk von Salzbrücken (Abb. 5G). Eine weitere elektrostatische Wechselwirkung entsteht durch den Kontakt von R118 aus einer Untereinheit mit E43 und E32 aus der langen Schleife der benachbarten Untereinheit (Abb. 5H). Wechselwirkungen zwischen Schichten beinhalten umfangreiche hydrophobe Wechselwirkungen, wobei die lange TTP-Schleife in der oberen Schicht mit drei TTPs aus den unteren Schichten der Bandscheibe interagiert (Abb. 5E). Der Rest T48 und zwei hydrophobe Reste mit langer Schleife, F46 und V33, kontaktieren die hydrophobe Oberfläche, die von den ersten beiden Untereinheiten gebildet wird (Abb. 5I). Die M38-Seitenkette, die dem M50 des Terminatorproteins ähnelt (ergänzende Abbildung 10B), fügt sich in die hydrophobe Tasche ein, die von den beiden früheren Untereinheiten gebildet wird (Abb. 5J), und die sperrige aromatische Seitenkette von W36 der langen Schleife wird eingeklemmt durch V49 und K107 von der oberen bzw. unteren Scheibe, um die Wechselwirkungen zwischen den Schichten weiter zu stabilisieren (Abb. 5K).

Die R4C-TMPs, die in der helikalen Rekonstruktion des Schwanzrohrs nur verschwommene Dichten zeigen, befinden sich im Lumen des Schwanzrohrs und können als Trimer vorliegen74,75. Sekundärstrukturvorhersagen legen nahe, dass R4C TMP ein Helix-Blatt-Helix-Motiv umfasst, das dem in RcGTA gefundenen ähnelt (ergänzende Abbildung 12A) . Der vorhergesagte TMP-N-Terminus weist eine lange hydrophobe α-Helix von 517 Resten auf und bildet bei Bildung eines Trimers einen dreisträngigen Kern-Coiled-Coil (ergänzende Abbildung 12A, B). Es wird angenommen, dass die folgende C-terminale Domäne von R4C TMP eine vergleichbare Topologie mit der Schwanznadel der Phagen P22 und HK60 aufweist, die die dreifache β-Helix und die invertierten kurzen α-Helices umfassen (ergänzende Abbildung 12A, C)76 ,77. R4C TMP spielt eine funktionell entscheidende Rolle bei der DNA-Translokation. Zwei kontinuierliche α-helikale Transmembransegmente (Reste 277–303, 309–327), die sich in der Mitte des R4C-TMP befinden (ergänzende Abbildungen 12A und 12D), können einen Kanal bilden, der die Bakterienhülle überspannt, um den genomischen Abbau durch periplasmatische Endonukleasen zu verhindern. Ähnliche TMP-unterstützende Aktivitäten werden bei anderen Phagen beobachtet (z. B. TP901-179 und T46). Es wird angenommen, dass der C-terminale integrierte Apparat an der Membranpenetration und der Strukturstabilisierung beteiligt ist76. Außerdem wird angenommen, dass sich die Peptidase, die den Peptidoglycan-Abbau verursacht80, neben der C-terminalen Domäne von TMP36 befindet (ergänzende Abbildung 12C).

Wir waren neugierig, warum der R4C-Phage als langer, gerader Schwanz erscheint, und versuchten, seine strukturelle Widerstandsfähigkeit durch Molekulardynamiksimulation (MD) zu untersuchen. Eine zweistufige MD wurde auf dem aus dem R4C-Schwanz entfernten 7-Scheiben-Röhrchen implementiert. Als Kontrolle diente der Schwanz eines anderen Phagen SPP172 mit vergleichbarer Länge für das 7-Scheiben-Röhrchen und ansonsten höherer Flexibilität. Zunächst wurde die gelenkte MD (SMD) eingesetzt, um eine Biegung der Rohre in vier repräsentativen Richtungen gegen die Heckachse zu induzieren (ergänzende Abbildung 13A), und dann wurde die konventionelle MD (CMD) an den Biegerohren berechnet, nachdem die SMD-Kraft aufgehoben wurde (ergänzende Abbildung). 13B, C). Die Ergebnisse zeigten, dass der R4C-Schwanz nach einer CMD-Simulation von 10 ns in jeder der vier Richtungen nahezu wieder in die ursprüngliche gerade Form zurückkehren konnte, wohingegen der SPP1-Kontrollschwanz seine Biegebewegung unverändert beibehielt (ergänzende Abbildung 13D), was darauf hindeutet, dass der R4C-Schwanz möglicherweise eine hervorragende Form aufweist Widerstandsfähigkeit, in der natürlichen Umgebung eine gerade Form beizubehalten. Andererseits fragten wir uns, ob die kompakte Schichtstapelung mit sechsfacher Symmetrie zur strukturellen Widerstandsfähigkeit des R4C-Schwanzes beitragen würde. Die MD unter Verwendung des strukturbasierten Modells (SMOG) anstelle von CMD wurde angewendet, um den Entbiegungsprozess des SMD-induzierten gebogenen R4C-Rohrs zu simulieren. Das SMOG-Modell basiert auf strukturabhängigen Eigenschaften von Einzelmolekül- oder Mehrmolekülanordnungen und filtert gleichzeitig Effekte im Zusammenhang mit intra- oder intermolekularen Wechselwirkungen heraus81. Interessanterweise bleibt der Biegewinkel des R4C-Schwanzes nach SMOG-basierter MD unverändert, was zeigt, dass die Widerstandsfähigkeit des R4C-Schwanzes eher auf molekulare Wechselwirkungen als auf Molekülstapelung zurückzuführen ist (ergänzende Abbildung 13E).

Die strukturelle Rekonstruktion des Schwanzendpunkts ist aufgrund seiner geringen Identifizierbarkeit und bevorzugten Ausrichtung in Kryo-EM-Bildern eine Herausforderung. Wir konnten jedoch einige 2D-Klassen erfassen, die die typischen Merkmale der Grundplatte während der spiralförmigen Rekonstruktion des Schwanzrohrs zeigen (Abb. 3C), was darauf hindeutet, dass der Schwanzendpunkt auch aus dem Filament-Tracer-Verfahren ausgewählt wurde. Die Rekonstruktion dieser Partikel, die eine C3-Symmetrie auferlegten, führte zu einer Karte mit einer Auflösung von 4,5 Å, die den Aufbau eines Cα-Rückgratmodells am Ende des R4C-Phagenschwanzes ermöglichte (ergänzende Abbildung 6D).

Der distale R4C-Schwanz, an dem das Schwanzrohr nach oben und die Grundplatte nach unten befestigt sind, ist ein C6-Hexamer, wie die C3-Rekonstruktion zeigt. Jedes Dit-Protein kann strukturell in zwei Domänen gespalten werden: Die Kerndomäne präsentiert sich als verdrehte β-Sandwich-Struktur mit zwei β-Haarnadeln und zwei Helices, während die aus der Röhrenoberfläche nach außen ragende Insertionsdomäne in einer fassartigen Falte organisiert ist verziert mit zwei Einsteckschlaufen (Abb. 6A, B). Die Kerndomäne, die den zentralen Kanal beherbergt, bietet Befestigungsstellen für das Endrohr und die Grundplatte (ergänzende Abbildung 14A). Beide Domänen des Dit-Monomers vermitteln Wechselwirkungen zwischen Untereinheiten. Die β1- und zwei Insertionsschleifen bilden eine Kerbe, um die α2 des benachbarten Monomers festzuklemmen und so die Festigkeit der Hexamer-Assoziation sicherzustellen (ergänzende Abbildung 14B). Kurze Schleifen von zwei benachbarten Monomeren und die α1- und β2-α2-Schleifen interagieren mit der langen Schleife eines Endrohrmonomers (ergänzende Abbildung 14C). Die lange Dit-Schleife verwendet einen L-förmigen β-Haarnadelgürtel, um eine flexible Oberfläche für eine optimale Bindung der Grundplatte zu schaffen und eine Symmetriefehlanpassung zwischen dem C6-Dit-Hexamer und dem C3-Megatron-Hub-Komplex zu vermitteln (ergänzende Abbildung 14D, E).

Eine Gauß-gefilterte C3-Dichtekarte des distalen Schwanzes und der Grundplatte wird in einer halbtransparenten weißen Oberfläche gerendert und die entsprechenden Modelle angezeigt und entsprechend den Proteinkomponenten eingefärbt. B Modelle jeder Komponente, farbcodiert nach Domäne. Die unbestimmte Clip-Domäne ist mit grauem Text markiert. C Detail eines Eisen-Schwefel-Clusters, der von vier Cys des Hub-Proteins koordiniert wird. Dargestellt ist die starke Dichte (graues Netz), die dem Eisen-Schwefel-Cluster entspricht. D Kopf-zu-Schwanz-Ansicht der Dichtekarte der Grundplatte mit den Iris-/Penetrationsdomänen von Megatron-Proteinen, markiert durch einen roten Pfeil. Das rechte Feld zeigt eine Nahaufnahme der N-terminalen α-Helix der Iris-/Penetrationsdomänen von drei Megatron-Proteinen, die gut in die Dichten des irisähnlichen Tores passen, wobei eine der Helixe rot hervorgehoben ist. Dargestellt ist der Innendurchmesser (~10 Å) des Tunnels.

Die Dit-Kerndomäne ist strukturell homolog zu der von RcGTA und dem Phagen T5 (RcGTA: Z-Score der DALI-Analyse = 8,4, Sequenzidentität = 36 %; T5: Z-Score = 7,3, Sequenzidentität = 6 %), was auf ihre evolutionäre Verwandtschaft hindeutet (Ergänzung). Abb. 9G, H)36,82. Die Dit-Insertionsdomäne von RcGTA gilt als homolog zu der des Phagen T5, der eine Oligosaccharid/Oligonukleotid-bindende (OB-ähnliche) Faltung annimmt und Wirtsadhäsionseigenschaften bietet36. Dennoch konnten wir keine strukturelle Ähnlichkeit für die Dit-Insertionsdomäne von R4C beobachten; Stattdessen ähnelt es dem N-Terminus der äußersten Domäne des Schwanzfaserproteins des Phagen T7 (ergänzende Abbildung 15E)83. PSI-BLAST- und Pfam-Analysen bestätigen Zusammenhänge zwischen dem R4C-Dit-Protein und Proteinen der Glycosid-Hydrolase-Familie, die Saccharide einfangen können84. Im Gegensatz zu T5 Dit spekulieren wir, dass R4C Dit als Schwanzadsorptionsapparat fungiert und die verschiedenen Zellwandrezeptoren/-komponenten erkennt.

Die C3-Grundplatte wird am distalen Ende des R4C-Schwanzes montiert (Abb. 3A). Die gesamte R4C-Grundplatte ist homolog zu der von RcGTA und beide bestehen aus Hub- (35,5 % Sequenzidentität), Megatron- (39,6 % Sequenzidentität) und Faserproteinen (30,4 % Sequenzidentität) (Abb. 6A, B). Gemäß der etablierten Nomenklatur ist das R4C-Hub-Protein in vier Domänen unterteilbar: die Bindungsdomäne (1–141), die Ionenbindungsdomäne (142–161, 244–266), die Oligosaccharidbindungsdomäne (162–243) und die Clipdomäne (267–266). 291) (Abb. 6B). Die Befestigungsdomäne stellt eine überwiegende Andockschnittstelle für den distalen Schwanz dar (ergänzende Abbildung 14D, E). Die Ionenbindungsdomäne, die aus zwei diskreten Segmenten besteht, nutzt vier konservierte Cys-Reste, um einen Eisen-Schwefel-Cluster zu koordinieren (Abb. 6C), der für die Schwanzassemblierung und die biologische Aktivität der Phagen essentiell ist85. Die Oligosaccharid-bindende Domäne kann durch horizontalen Gentransfer entstehen, und die Saccharid-bindende Eigenschaft – vermutlich wirtsspezifisch – verstärkt die Zelladhäsion.

Das Megatron-Protein ist in sechs Domänen unterteilt: Iris/Penetration (1–45), adhäsionsartig (46–211), peripher (212–481, 630–903), kohlenhydratbindend (482–629), zentral (904). –1130) und faserbindende Domänen (1131–1447) (Abb. 6B). Die Iris-/Penetrationsdomäne ist hochflexibel, mit Ausnahme ihrer N-terminalen α1-Helices, die einer spürbaren Dichte innerhalb des Grundplattenkanals entsprechen (Abb. 6D). Die drei α1-Helices der drei Megatron-Proteine ​​bilden im geschlossenen Zustand ein irisartiges Tor (Innendurchmesser ~10 Å), das dem von RcGTA36 ähnelt; Diese Struktur trägt dazu bei, den Ausbruch genomischer DNA zu verhindern. Die Iris-/Penetrationsdomäne ermöglicht die Bildung einer Transmembranhelix (ergänzende Abbildung 15A, B), die dazu dienen kann, die äußere Membran zu durchdringen und eine Pore für den Frachttransport zu schaffen. Wir spekulieren, dass sowohl die membrandurchspannenden Helices des Megatrons als auch die TMPs den Transmembrankanal für die DNA-Translokation durch die verschiedenen Schichten der Bakterienmembran bilden. Die zentrale Domäne, die dieselbe Topologie wie die Kerndomäne des distalen Schwanzes aufweist, ist hauptsächlich an der Bindung des distalen Schwanzes beteiligt (ergänzende Abbildung 14D, E). Unterhalb der zentralen Domäne befindet sich die Adhäsin-ähnliche Domäne, wo der Schwanztunnel endet. Die adhäsionsähnliche Domäne ist teilweise sehr flexibel und enthält eine ungeordnete Schleife (Reste 95–113) (Ergänzende Abbildung 15A, C). Es wird vorhergesagt, dass sich die periphere Domäne evolutionär zu einer Mannanase-ähnlichen Struktur faltet (ergänzende Abbildung 15F, G). Darüber hinaus wird im Vergleich zu RcGTA eine zusätzliche Domäne gefunden, die über die periphere Domäne hinausgeht (ergänzende Abbildung 15A). Wir bezeichnen diese Domäne als Kohlenhydrat-bindende Domäne, da sie eine ähnliche Topologie mit dem Kohlenhydrat-bindenden Modul von Clostridium thermocellum (CtCBM11) aufweist, das verschiedene Poly- und Oligosaccharide bindet (Ergänzende Abbildung 15H, I)86. Schließlich besteht die Faserbindungsdomäne unten aus drei separaten Regionen: Zwei stellen eine Schnittstelle für die Bindung von Faserproteinen dar, während die dritte möglicherweise dazu bestimmt ist, die Basis der Grundplatte in einem metastabilen Zustand zu halten (Abb. 6B). .

Jeder der drei dreibeinigen trimeren Faserkomplexe wird durch eine Kombination von drei Schwanzfasermonomeren gebildet, in denen die Regionen Kopf (1–35), Körper (36–117) und Fuß (118–230) als bezeichnet werden die Stab-, Knopf- und Fußdomänen (Abb. 6A, B). Die Stabdomäne ist eine Coiled-Coil-Domäne mit einer N-terminalen Verlängerung, die an die Megatron-Faserbindungsdomäne bindet (Abb. 6B). Die Knopfdomäne verbindet den Stab mit dem C-terminalen Fuß, einer β-Faltblatt-reichen Domäne mit einer Lektin-ähnlichen Faltung (ein 8-strängiges antiparalleles Beta-Fass), das Kohlenhydrate binden kann (Abb. 6B). 87.

Viele Meeresbakterien, einschließlich Roseobacter, produzieren Kapselpolysaccharide, um ihre Konkurrenz und Anpassung an die Meeresumgebung zu verbessern88,89; Dies stellt gleichzeitig eine Fülle von Kohlenhydraten für die Phagenerkennung bereit. Dementsprechend rüstet der R4C-Phage verschiedene kohlenhydratbindende Zubehörteile aus, darunter die Dit-Insertionsdomäne, die kohlenhydratbindenden und peripheren Megatron-Domänen, die Hub-Oligosaccharid-bindende Domäne und die Faserfußdomäne, um sich an die Bakterienkapsel zu binden. Diese spezifischen Strukturkomponenten sind für die Phageninfektion von wesentlicher Bedeutung, da sie die Verankerung des bakteriellen Wirts erleichtern.

Aufgrund der Genomanalyse wird angenommen, dass das GTA von (Pro)Phagen stammt, insbesondere von Genen, die für schwanzbezogene Proteine ​​kodieren90,91. Wir haben eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zwischen den schwanzbezogenen Proteinen von R4C und RcGTA festgestellt: Dies liefert weitere Beweise für die evolutionäre Korrelation zwischen GTA und Bakteriophagen und ermöglicht es uns, eine ökologische Perspektive für ihre Beziehung vorzuschlagen. GTA-Expression und -Sekretion werden von Bakterien durchgeführt, um die Wirtspopulation aufrechtzuerhalten90,91. GTA-kodierende Gene im Wirt können aus Phagen gewonnen werden, da die Integrasen (integrierende Enzyme) und Repressoren es den Phagen ermöglichen, ihre Genome in die Wirtsgenome zu integrieren, wodurch der Wirt gewinnbringende Gene von Phagen für die GTA-Produktion und -Evolution erwerben kann. Dennoch zeigt die phylogenetische Analyse, dass die GTA-Gene in D. shibae DFL12 und ihre spezifischen Phagengene, einschließlich derjenigen von R4C, nicht eng miteinander verwandt sind (ergänzende Abbildung 16), was auf eine getrennte Entwicklung bei Bakterien und Phagen schließen lässt.

Umgekehrt können Phagen unter bestimmten Umständen GTA-kodierende Gene vom Wirt erhalten. Die meisten schwanzbezogenen Proteine ​​des R4C-Phagen zeigen eine strukturelle und möglicherweise funktionelle Konservierung mit der GTA, von der Phagen profitieren können. Genauer gesagt sind die guten Wachstumsbedingungen der Wirtsbakterien92,93, die für eine hohe GTA-Expression und -Sekretion entscheidend sind, auch für eine Virusinfektion und -produktion geeignet. Andererseits erfolgt der GTA-vermittelte horizontale Gentransfer weitaus umfassender (über den Stamm hinweg) als in seinem Wirtsbereich94, was bedeutet, dass GTA in ein breiteres Spektrum von Bakterien eindringen kann. Unter Berücksichtigung dieser Überlegungen könnten Roseophagen wie R4C, die über ähnliche Bindungs-, Adsorptions-, Eintritts- und DNA-Abgabemechanismen verfügen, das Potenzial haben, das evolutionäre Wettrüsten zwischen Virus und Wirt zu gewinnen und einen größeren ökologischen Vorteil gegenüber anderen Phagen zu zeigen.

Basierend auf der In-situ-Struktur des intakten R4C-Virions und unserer vergleichenden Analyse viraler Proteine ​​und ihrer homologen Strukturen schlagen wir einen DNA-Abgabemechanismus des R4C-Phagen vor (Abb. 7). Wir vermuten, dass der R4C-Phage zunächst an Wirtsbakterien haftet, indem er mithilfe der zusätzlichen Domänen der distalen Schwanzproteine ​​​​und/oder der Megatron-Proteine ​​​​Wechselwirkungen mit dem spezifischen bakteriellen Rezeptor (z. B. Kapselpolysaccharide) oder seinen Co-Faktoren herstellt (ergänzende Abbildung 15A). ). Die drei trimeren Faserproteine ​​fungieren als Anker und orientieren den Phagen. Anschließend treiben sie die Grundplatte in Richtung der Außenmembran, um sich fest an den Bakterienwirt zu heften. Dann kommt es zu kaskadierenden Konformationsumlagerungen innerhalb der Grundplatte und sogar des gesamten Schwanzes, die eine weitere Öffnung des Schwanztunnels aus seinem geschlossenen Zustand auslösen. Anschließend werden die hydrophoben N-Termini der Megatron-Proteine, die den Riegel bilden (Abb. 6D), freigelegt und fügen sich dann in die äußere Membran der Bakterien ein, um eine Transmembranpore zu bilden. Die Freisetzung der Peptidase führt dann zum Abbau der Peptidoglycanschicht zwischen der äußeren und inneren Membran der Bakterien. Die TMPs verlassen den Schwanz und gelangen in den periplasmatischen Raum, wobei sie vermutlich die bakterielle Zellhülle überspannen und mithilfe ihrer Transmembransegmente einen Kanal durch die innere Membran bilden (ergänzende Abbildung 12); Dieser Transport erfordert möglicherweise die Hilfe von Glukosetransportproteinen78. Der TMP-Austritt kann wiederum eine Signaltransduktion vom Terminator zum Portal auslösen, die als eine Reihe aufeinanderfolgender struktureller Veränderungen (z. B. der Portaltunnelschleife) erscheint, die schließlich die Genomtranslokation einleiten. Der im Phagenkopf gespeicherte Druck treibt die genomische DNA in den Kanal des Schwanzrohrs. Dies reicht jedoch möglicherweise nicht aus, um das gesamte Genom gegen den inneren osmotischen Druck der Bakterienzelle zu bewegen95,96. Die negativ geladene Spur auf der Innenfläche des Schwanzrohrs (ergänzende Abbildung 11), ergänzt durch die gerade röhrenförmige Architektur (Abb. 5), unterstützt den Durchgang der DNA durch den langen Schwanz. Schließlich wird das Genom über den von den TMPs gebildeten Kanal in die Wirtsbakterien ausgeschleust.

A Das reife R4C-Virion. B Das R4C-Virion erkennt den Wirtsrezeptor oder Co-Faktor und bindet ihn über sein distales Schwanzprotein oder seine Grundplatte. C Die Schwanzfaserproteine ​​ermöglichen es R4C, mithilfe seiner Schwanzachse weiter an die Wirtsoberfläche zu binden. D Penetration der äußeren Membran durch die Megatron-Protein-Iris-/Penetrationsdomäne. E Abbau der Peptidoglycanschicht des Wirts durch Zellwandpeptidase. F Die Maßbandproteine ​​(TMP) werden freigesetzt und bilden einen Kanal durch die Wirtsmembran. G Ausstoß des Genoms in das Zytoplasma des Wirts über den TMP-Kanal. H Das leere R4C-Partikel.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Genomfreisetzung von R4C und anderen Schwanzphagen über einen komplexen kollaborativen Prozess erfolgt, der durch verschiedene Strukturproteine ​​vermittelt wird. Weitere Details zur Vervollständigung des Verfahrens müssen noch weiter geklärt werden.

Das Wirtsbakterium D. shibae DFL12 wurde bei 28 °C in RO-Medium (1 g/L Hefeextrakt, 1 g/L Pepton und 1 g/L Natriumacetat bei pH 7,5) unter Schütteln bei 160 U/min gezüchtet. Die vB_DshS-R4C-Stammlösung in SM-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl und 8 mM MgSO4) wurde zu DFL12 gegeben, als die OD600 des Wirts 0,2–0,3 betrug. Nach 24-stündiger Infektion wurde das Lysat 10 Minuten lang bei 8000 U/min zentrifugiert und durch eine 0,2-μm-Polycarbonatmembran (Merck Millipore) filtriert, und die wässrige Phase wurde mit 10 % (Gew./Vol.) gelöstem Polyethylenglykol (PEG) 8000 präzipitiert und NaCl (1 M) bei 4 °C für 30 Stunden. Die Mischung wurde dann 50 Minuten lang bei 4 °C und 10.000 × g zentrifugiert, und das Pellet wurde vorsichtig in 5 ml SM-Puffer resuspendiert und mit einem CsCl2-Dichtegradienten (1,3 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1,7 mg/ml) gereinigt. ml; 34100 × g, 4 °C, 24 h). Gereinigte Phagenpartikel wurden gesammelt und zweimal mit SM-Puffer über Nacht im Dunkeln bei 4 °C dialysiert.

Aliquote von 3 μl des gereinigten R4C-Phagen wurden unter Verwendung eines Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) auf glühentladene (60 s bei 20 mA) löchrige Kohlenstoff-Quantifoil-Gitter (R1.2/1.3, 200 Mesh, Quantifoil Micro Tools) geladen 100 % Luftfeuchtigkeit und 4 °C. Die Daten wurden mit einem FEI Tecnai F30-Transmissionselektronenmikroskop (Thermo Fisher Scientific) erfasst, das bei 300 kV betrieben und mit einem Falcon 3-Direktelektronendetektor ausgestattet war. Die Bilder wurden im 39-Frame-Filmmodus mit einer nominalen 93.000-fachen Vergrößerung und einer Pixelgröße von 1,12 Å aufgenommen. Die Gesamtelektronendosis wurde auf 30 e− Å−2 eingestellt und die Belichtungszeit betrug 1 s. Die Daten wurden automatisch mit der Thermo Fisher EPU-Software erfasst.

Mit MotionCor297 wurde eine Drift- und strahlinduzierte Bewegungskorrektur durchgeführt, um von jedem Film eine mikroskopische Aufnahme zu erstellen. Die Anpassung der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) und die Schätzung der Phasenverschiebung wurden mit Gctf98 durchgeführt. Mikroskopische Aufnahmen mit Astigmatismus, offensichtlicher Drift oder Kontamination wurden verworfen. Die folgenden Rekonstruktionsverfahren wurden mit Cryosparc V399 durchgeführt. Kurz gesagt, Partikel des R4C-Kopfes wurden automatisch mit dem „Blob-Picker“ und dann mit dem „Template-Picker“ aufgenommen, während der „Filament-Tracer“ für den zylindrischen R4C-Schwanz verwendet wurde, um die Dichtepartikelaufnahme entlang der Schwanzachse zu erleichtern. Mehrere Runden referenzfreier 2D-Klassifizierungen für zwei Datensätze ergaben zwei unterschiedliche Arten von Klassen, von denen eine das Schwanzrohr und die andere das distale Ende des R4C-Schwanzes darstellte. Ausgewählte gute Partikel des Kapsids und des distalen Schwanzes wurden beide einer Ab-initio-Rekonstruktion und einer homogenen Verfeinerung unterzogen, wodurch eine I2- bzw. C3-Symmetrie erzielt wurde. Partikel des Schwanzrohrs wurden mehreren Iterationen der Spiralrekonstruktion und des Symmetriesuchprozesses unterzogen, um die Symmetrie, den Anstieg und die Drehung des Spiralschwanzes genau zu bestimmen und schließlich die Dichtekarte zu erhalten. Die Auflösung der Dichtekarten für das Kapsid und das Endrohr wurde durch die Goldstandard-Fourier-Schale-Korrelationskurve mit einem Grenzwert von 0,143100 bestimmt. Die lokale Kartenauflösung wurde mit ResMap101 geschätzt.

Die in Cryosparc vorverarbeiteten Bilder wurden zur weiteren Rekonstruktion des R4C-Halses in Relion 3.1 importiert. Kurz gesagt, Hunderte von Partikeln des R4C-Kopfes wurden manuell ausgewählt und einer 2D-Klassifizierung (Bin2) unterzogen. Die am besten definierten 2D-Klassenmittelwerte wurden zur automatischen Partikelauswahl in allen Mikroaufnahmen verwendet. Um die I3-Rekonstruktion des Kapsids zu erhalten, wurden eine 2D-Klassifizierung und eine 3D-Verfeinerung (bin2) durchgeführt. Anschließend wurden 14.776 Partikel extrahiert (bin1) und der Symmetrieerweiterung in Relion unter Verwendung der I3-Symmetrie unterzogen. Unterpartikel aus den fünfzähligen Scheitelpunkten wurden erneut extrahiert; diejenigen, die den C12-Portalscheitelpunkt darstellen, wurden mithilfe der 3D-Klassifizierung herausklassifiziert, die eine C5-Symmetrie vorsah. Um die Halsproteine ​​zu bestimmen, wurden weitere symmetrieerweiterte (C5) und 3D- (C12) Klassifizierungen durchgeführt, die fünf Klassen des Portalscheitelpunkts mit unterschiedlichen globalen Ausrichtungen ergaben, die sich um 72° unterschieden; Alle diese fünf Klassen wiesen ein typisches Merkmal des Dodekameraportals und -adapters auf. Basierend auf Partikeln aus einer der fünf Klassen wurden lokalisierte Subpartikelrekonstruktionen unter Verwendung verschiedener Symmetrien und Masken durchgeführt, um die Dichtekarten des C1-Portalscheitelpunkts, des C5-Portalscheitelpunkts, des C6-Portalscheitelpunkts bzw. des C12-Portalscheitelpunkts zu erhalten .

Das ursprüngliche Modell des R4C-MCP wurde aus einer Homologiemodellierung basierend auf dem Atommodell des MCP von HK97 (PDB-ID: 1OHG) mit der Accelrys Discovery Studio-Software (verfügbar unter: URL: https://www.3dsbiovia.com) generiert. Für Schwanzkomponenten wurden ihre Sequenzen dem Proteinstruktur-Vorhersageserver trRosetta (verfügbar unter der URL: https://yanglab.nankai.edu.cn/trRosetta/)48 unterzogen, wobei die vorhergesagten Modelle als Ausgangsmodell für die weitere Verfeinerung dienten. Wir haben die Templates zunächst mit Chimera102 in die entsprechenden endgültigen Kryo-EM-Karten eingepasst. Im Detail wurden die Kapsidproteine ​​in die I2-Kopfkarte, die Portal- und Adapterproteine ​​in die C12-Halskarte und die Stopper- und Terminatorproteine ​​in den C6-Hals eingepasst Karte, die Schwanzrohrproteine ​​in die C6-Schwanzkarte, der Grundplattenkomplex, distale Schwanz- und Schwanzfaserproteine ​​in die C3-Basiskarte. Alle Modelle wurden manuell durch Realraumverfeinerung in Coot103 korrigiert und angepasst. Da der R4C-Hals und die Basis schwache Dichten aufwiesen, haben wir die Rückgratmodelle nur für Portal-, Adapter-, Stopper-, Terminator-, distale Schwanz-, Megatron-, Hub- und Schwanzfaserproteine ​​erstellt. Für die wichtigsten Kapsid- und Schwanzrohrproteine ​​wurden die resultierenden Modelle mit phenix_real_space_refine in PHENIX104 weiter verfeinert. Diese Operationen wurden iterativ ausgeführt, bis die Problemregionen, Ramachandran-Ausreißer und schlechte Rotamere entweder eliminiert oder in bevorzugte Regionen verschoben wurden. Die Gesamtheit dieser sieben asymmetrischen Kapsideinheiten wurde einer weiteren Verfeinerung im realen Raum unterzogen, um die Zusammenstöße zu optimieren. Die endgültigen Atommodelle wurden mit Molprobity105,106 validiert. Der Sequenzabgleich wurde mit Clustal Omega auf dem EBI-Server (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) durchgeführt. Alle Figuren wurden mit Chimera oder ChimeraX107,108 generiert.

Zunächst wurden Simulationen der gelenkten Molekulardynamik (SMD) eingesetzt, die als Modellbauwerkzeug dienten, um künstlich gebogene Strukturen der R4C- und SPP1-Endrohre zu erzeugen. Die aus SMD-Simulationen extrahierten endgültigen Strukturen wurden einer konventionellen MD (CMD) unterzogen, wobei die Kraft entfernt wurde, um die Elastizität des Schwanzes abzuschätzen, indem die Biegewinkeländerungen des entsprechenden Schwanzrohrs verfolgt wurden. Um dies zu erreichen, wurden Atommodelle verwendet, die aus sieben Scheiben der Schwanzrohrproteine ​​R4C und SPP1 (PDB-ID: 6YQ5) bestehen. Die vorbereiteten Modelle wurden in VMD109 an Autopsf übermittelt, um Topologieinformationen zu generieren. Die Struktur wurde mithilfe des TIP3P-Wasserpotentialmodells (übertragbares intermolekulares Potenzial mit drei Wechselwirkungsstellen) in die explizite Lösungsmittelbox (Wasser) eingebettet, die 12 Å von der Proteingrenze entfernt war110. Das System wurde durch Zugabe von Gegenchloridionen neutralisiert, um eine Nullladung zu erreichen, gefolgt von zusätzlichen Natrium- und Chloridionen bis zu einer physiologischen Endkonzentration von 0,15 M. Wir haben in unserer Simulation das CHARMM36-Kraftfeld angewendet und periodische Randbedingungen eingesetzt, um einen Randeffekt zu vermeiden.

Die beiden vorbereiteten Systeme wurden einer SMD-Simulation unterzogen, wobei die Kraft auf CA-Atome aus den mittleren fünf Schichten des sieben Scheiben-Endrohrs ausgeübt wurde. Die einwirkenden Kräfte nehmen von der mittleren Schicht zu beiden flankierenden Schichten ab, um eine kontinuierliche Biegung zu bewirken. Die auf die mittleren Schichten ausgeübte Kraft wurde auf 2,08, 1,38 kcal/mol/Å für die 3./5. Schicht und 0,69 kcal/mol/Å für die 2./6. Schicht eingestellt. Das Schwanzrohr wurde dazu veranlasst, sich in vier repräsentativen Richtungen (0°, 15°, 30°, 45°) zwischen zwei Untereinheiten (im 60°-Intervall) der sechszähligen Symmetrieschicht zu biegen, die Richtungen verliefen gegen die Schwanzachse (ergänzende Abbildung). 13A). Dabei zeigt die Richtung bei 0° vom Massenschwerpunkt (COM) einer Kette zum Massenschwerpunkt der gegenüberliegenden Kette. Jede SMD-Simulation wurde mit einer Dauer von 150 Pikosekunden (ps) durchgeführt, und dann wurden zusätzliche CMD-Simulationen mit einer Dauer von 10 Nanosekunden (ns) eingesetzt. Jede CMD-Simulation wurde fünfmal wiederholt. Der Biegewinkel, der die 7-Scheiben-Rohrform widerspiegelt, wurde durch die drei Punkte definiert, die den COMs der oberen, mittleren und unteren Schicht des Rohrs entsprechen. Die mögliche Variation der Biegewinkel wird im gesamten MD überwacht.

MD-Simulationen wurden mit dem NAMD-MD-Paket Version 2.13111 durchgeführt. Der Integrationszeitschritt der Simulation wurde auf 1 Femtosekunde (fs) eingestellt und die Positionskoordinaten (DCD-Datei) wurden alle 0,2 ps für SMD und alle 4 ps für CMD zur weiteren Analyse gespeichert. Periodische elektrostatische Wechselwirkungen über große Entfernungen wurden mithilfe der Smooth Particle-Mesh Ewald (PME)112-Methode mit einem realen Grenzradius von 10 Å bewertet. Die Längen aller chemischen Bindungen, an denen Wasserstoffbrückenbindungen beteiligt sind, wurden durch den SHAKE-Algorithmus113 eingeschränkt. CMD-Simulationen wurden bei 310 K durchgeführt und die konstante Temperatur wurde durch Langevin Dynamics114 unter einem Druck von 1 atm115 gesteuert, der mit dem Nose-Hoover-Thermostat aufrechterhalten wurde. Die konstante Temperaturregelung wurde bei SMD abgeschaltet, um die Freiheit der Atome zu verringern. Vor jeder Produktion wurde das System durch 2000 konjugierte Gradientenschritte energieminimiert, um sterische Konflikte zwischen Wassermolekülen und dem Protein zu reduzieren. Die dynamischen Ergebnisse wurden mit dem VMD-Programm analysiert.

Die auf All-Atom-SMOG basierende Simulation – ein nativ-zentriertes Modell, das die vollständigen atomaren Strukturdetails beibehält – wurde durchgeführt, um das Gewicht der molekularen Struktur zu untersuchen, die zur Widerstandsfähigkeit des Phagen-R4C-Schwanzes beiträgt. Die Rohrstruktur aus der SMD-Simulation (0°) wurde dem SMOG-Modell-Webserver116 unterzogen, um die Kraftfelddatei zu generieren. MD-Simulationen wurden für 1,0 × 108 Zeitschritte mit einer Dauer von 0,0005 reduzierten Einheiten (insgesamt 50 ns) unter Verwendung von Gromacs (v4.6.7)117 durchgeführt. Langevin Dynamics-Protokolle wurden verwendet, um eine konstante Temperatur von 0,4 (reduzierte Einheiten) sicherzustellen. Jede SMOG-basierte MD-Simulation wurde fünfmal wiederholt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die diese Studie unterstützen, sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die Kryo-EM-Dichtekarten wurden in der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) mit den Zugangscodes EMD-34247 (Kapsid), EMD-34253 (C1-Portalscheitelpunkt), EMD-34254 (C5-Portalscheitelpunkt), EMD- hinterlegt. 34250 (C12-Portalscheitel), EMD-34252 (C6-Stopper-Terminator), EMD-34248 (Endrohr), EMD-34249 (distaler Schwanz und Grundplatte) und die entsprechenden Atomkoordinaten wurden in der Proteindatenbank (PDB) hinterlegt ) mit den Zugangscodes 8GTA (Kapsid), 8GTD (C12-Portal-Adapter), 8GTF (C6-Stopper-Terminator), 8GTB (Endrohr), 8GTC (distaler Schwanz und Grundplatte). Atomkoordinaten zuvor ermittelter Strukturen sind im PDB unter den folgenden Zugangscodes verfügbar: 1OHG, 5WK1, 6TSU, 5LII, 5VF3, 6TB9, 6J3Q, 7VIK, 6XGQ, 6I9E, 6QVK, 5UU5, 5L35, 3JA7, 6QX5, 6IBG, 6QJT , 6TE8, 2KX4, 2KCA, 3F3B, 6TE9, 2LFP, 3FZ2, 6YQ5, 5W5F, 6TSV, 4JMQ, 6TEH, 2POH, 7BOZ, 7DVJ, 2LRP. Die in dieser Studie generierten MD-Simulationsdaten wurden in der Zenodo OpenAIRE-Datenbank unter dem Zugangscode 7947658 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Zuschüsse Nr. 42188102 und 91951209 an RZ, Nr. 32170942 an QZ und Nr. 81991491 an NX).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yang Huang, Hui Sun, Shuzhen Wei.

Staatliches Schlüssellabor für molekulare Vakzinologie und molekulare Diagnostik, School of Public Health, School of Life Sciences, Universität Xiamen, Xiamen, 361102, China

Yang Huang, Hui Sun, Liqin Liu, Yanan Jiang, Jiabao Xin, Zhenqin Chen, Yuqiong Que, Zhibo Kong, Tingting Li, Hai Yu, Jun Zhang, Ying Gu, Qingbing Zheng, Shaowei Li und Ningshao Xia

Nationales Institut für Diagnostik und Impfstoffentwicklung bei Infektionskrankheiten, Universität Xiamen, Xiamen, 361102, China

Yang Huang, Hui Sun, Liqin Liu, Yanan Jiang, Jiabao Xin, Zhenqin Chen, Yuqiong Que, Zhibo Kong, Tingting Li, Hai Yu, Jun Zhang, Ying Gu, Qingbing Zheng, Shaowei Li und Ningshao Xia

State Key Laboratory of Marine Environmental Science, Fujian Key Laboratory of Marine Carbon Sequestration, College of Ocean and Earth Sciences, Xiamen University, Xiamen, 361102, China

Shuzhen Wei & Rui Zhang

Abteilung für Meereswissenschaften, Hong Kong University of Science and Technology, Hongkong, China

Lanlan Cai

Institut für fortgeschrittene Studien, Universität Shenzhen, Shenzhen, 518060, China

Rui Zhang

Forschungseinheit für Grenztechnologie der strukturellen Vakzinologie, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften, Xiamen, 361102, China

Ningshao Xiao

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QZ, SL, RZ und NX haben das Projekt konzipiert. YH, HS und SW haben die Experimente entworfen. YH, HS, SW, LC und JX führten die Experimente durch. LL, ZC und YJ sammelten die Kryo-EM-Daten. YH, HS, QZ und SL bestimmten die Strukturen und fertigten Figuren an. YQ, ZK, TL, HY, JZ und YG beteiligten sich an der Diskussion und Interpretation der Ergebnisse. SL, QZ, RZ, YH, HS und SW haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren trugen zur Datenanalyse und Manuskripterstellung bei.

Korrespondenz mit Qingbing Zheng, Shaowei Li, Rui Zhang oder Ningshao Xia.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Kazuyoshi Murata und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Huang, Y., Sun, H., Wei, S. et al. Struktur und vorgeschlagener DNA-Abgabemechanismus eines marinen Roseophagen. Nat Commun 14, 3609 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39220-y

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Eingegangen: 12. September 2022

Angenommen: 02. Juni 2023

Veröffentlicht: 17. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39220-y

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